Влияние взаимодействия аминокислот и пептидов белков молока с хитозаном на органолептические и антиоксидантные свойства их комплексов Аннотация: Введение. Комплексы хитозана и его производных с аминокислотами и гидролизованными белками молочной сыворотки – перспективный биологически активный ингредиент для продуктов специализированного питания. Целью исследования являлось получение биокомпозитов хитозана с пептидами и аминокислотами, характеризующихся высокой антиоксидантной активностью и улучшенными вкусовыми свойствами. Объекты и методы исследования. В качестве объектов исследования применяли биокомпозиты хитозана и сукцинилированного хитозана с пептидами сыворотки молока и аминокислотами. Антирадикальный эффект определяли по восстановлению флуоресценции флуоресцеина при внесении в тест-систему опытных образцов. Уровень горечи чистых соединений и их комплексов с хитозаном оценивали органолептически. Результаты и их обсуждение. Изучены условия комплексообразования хитозана (ХТ) и сукцинилированного хитозана (СХТ) с протеиногенными аминокислотами (Трп, Лей, Мет, Вал, Арг) и пептидами сыворотки молока. Согласно экспериментальным данным, в водном растворе ХТ достигается связывание Трп, Лей и Вал в эквимолярном соотношении (в расчете на содержание глюкозамина). Подтверждено менее эффективное взаимодействие Мет с образцами ХТ, тогда как формирование комплексов ХТ и СХТ с Арг не установлено. По результатам оценки биокомпозитов ХТ и СХТ с пептидами и аминокислотами (Лей, Мет, Вал) отмечено уменьшение горечи. Изменение органолептических показателей образцов ХТ и СХТ с Арг не выявлено. При взаимодействии Трп и пептидов с ХТ установлено возрастание их антиоксидантной активности в 1,7 и 2,0 раза соответственно, тогда как в случае СХТ – в 1,5 раза. Выводы. Показано увеличение антиоксидантной активности Трп и пептидов сыворотки молока в составе с ХТ и СХТ, улучшение органолептических свойств комплексов. Эффективность комплексообразования аминокислот и пептидов с ХТ выше, чем СХТ в связи с бóльшим содержанием протонированных аминогрупп, наиболее активно взаимодействующих с отрицательно заряженными группами аминокислот. Ключевые слова: хитозан, сукцинилированный хитозан, пептиды сыворотки молока, протеиногенные аминокислоты, биокомпозиты хитозана Введение Белковый компонент молока является источником биологически активных пептидов, образующихся в результате расщепления ферментами желудочно-кишечного тракта. При промышленном производстве специализированных гипоаллергенных продуктов белки молока подвергают ферментативному гидролизу [1, 2]. Протеолиз обеспечивает повышение биоактивного потенциала белков благодаря образованию специфических функциональных пептидов [3]. Снижение аллергенности белков молока достигается путем расщепления областей антигенных детерминант в структуре белков-аллергенов [4]. Гидролизованные белки коровьего молока, представленные пептидами с короткой цепью и аминокислотами (АК), обладают характерным горьким вкусом, что связано с наличием "горьких" аминокислот (гистидин, пролин, фенилаланин, тирозин, триптофан). Специфический вкус обусловливает ограниченное использование гипоаллергенных гидролизатов в пищевой промышленности [5]. Известен ряд способов, направленных на улучшение вкусовых характеристик гидролизованных белков (метод гидрофобной хроматографии, использование специфических сорбентов, фокусирование в изоэлектрической точке, ограниченный протеолиз) [6]. Использование инструментальных методов обработки гидролизатов приводит к высоким производственным затратам, изменению аминокислотного состава за счет удаления незаменимых аминокислот, а также связано со сложностью применения специфических ферментов в технологических процессах и необходимостью удаления токсичных компонентов и сопутствующих продуктов производства. Практикуется внесение вкусо-ароматических добавок для маскировки горечи продуктов [7]. Актуальным является поиск и разработка альтернативных способов снижения горечи белковых гидролизатов и смесей аминокислот. Циклические олигосахариды, или циклодекстрины, благодаря пространственной структуре, подобной конусу с гидрофобной внутренней полостью, обладают способностью образовывать клатраты (комплексы включения) с "гостевыми" молекулами различной природы [8]. Включение в полость циклодекстринов специфических "горьких" пептидов и аминокислот обеспечивает улучшение их вкусовых свойств за счет экранирования от взаимодействия с вкусовыми рецепторами [9, 10], оказывает влияние на биологически активный потенциал включаемых соединений [11, 12]. Помимо использования циклических олигосахаридов, улучшение органолептических свойств "горьких" аминокислот и пептидов предполагается реализовать посредством комплексообразования с аминополисахаридом хитозаном (ХТ). Хитозан относится к малотоксичным веществам, разрешен к применению в пищевой промышленности в качестве наполнителя, загустителя, стабилизатора [13]. Комплексообразование природных биополимеров и биоактивных веществ с различным по молекулярной массе ХТ и его производными обусловливает возможность получения композитов с перспективными свойствами. Так, хитозан представляет собой потенциальный комплексообразующий агент, способный взаимодействовать с рядом соединений органической природы посредством гидрофобного эффекта, образования ионных и водородных связей [14]. Наряду с высокой биосовместимостью и выраженными адсорбционными свойствами, аминополисахарид характеризуется ограниченной растворимостью [15]. Данное свойство препятствует расширению применения ХТ в различных отраслях промышленности, особенно в пищевой и фармацевтической отрасли. При активной кислотности среды <6,5 ед. рН свободные аминогруппы полисахарида находятся в протонированном состоянии, что определяет поликатионные свойства хитозана [16]. Деполимеризация и химическая модификация аминополисахарида направлены на получение растворимых форм ХТ [17]. В результате сукцинилирования хитозана, связанного с введением анионных сукцинатных групп, достигается высокая растворимость соответствующего производного при активной кислотности среды >7,0 и <4,5 ед. рН [18]. Согласно результатам молекулярного моделирования электростатическое взаимодействие карбоксильной группы аминокислоты с аминогруппой хитозана представляется наиболее вероятным вариантом комплексообразования [19]. В соответствии с обзорными данными [20–28] взаимодействие хитозана и его производных с аминокислотами может быть разделено на 3 типа. 1) Формирование из хитозана гелеобразной основы – гидрогеля (плёнки, сферы и т.п.), где аминокислоты иммобилизованы внутри основы либо адсорбированы на поверхности. В некоторых случаях аминокислоты дополнительно химически сшиты с молекулами хитозана в составе плёнки [20–23]. 2) Химическое сшивание молекул хитозана и аминокислоты. Данный способ часто используют для получения биокомпозитов, к которым в дальнейшем присоединяют различных молекулы, доставляемые к месту их действия (мишень) [24–26]. 3) Взаимодействие хитозана и аминокислот в растворе. Третий тип основан на связывании соединений различной природы с NH2 группами полисахарида. Получены различные модификации ХТ, с которыми взаимодействуют целевые молекулы, применяемые в генной терапии, упаковке, при доставке лекарств, очистке сточных вод и др. [27, 28]. Для экспериментальной работы выбран третий тип получения биокомпозитов хитозана и аминокислотами (взаимодействие ХТ и АК в растворе) в связи с доступностью технического исполнения и относительно невысокой стоимостью. Основная идея исследования заключается в применении биокомпозитов ХТ–АК как компонента продуктов питания. Упомянутые высокомолекулярные комплексы будут иметь ограниченные возможности взаимодействия с рецепторами горького вкуса, что улучшит органолептические свойства гидролизатов белков молока. Предполагается беспрепятственное высвобождение пептидов и аминокислот из биокомпозита при прохождении желудочно-кишечного тракта за счет разрушения непрочных сил электростатического взаимодействия. В настоящее время актуальным является получение биокомпозитов хитозана и его производных с пептидами и аминокислотами как функционального ингредиента продуктов специализированного питания. Научная значимость работы состоит в получении новых данных о влиянии комплексообразования с хитозаном и его производными на биологически активные свойства (антиоксидантная активность) и органолептические показатели аминокислот и пептидов. Цель работы – получение биокомпозитов хитозана с пептидами и аминокислотами, характеризующихся высокой антиоксидантной активностью и улучшенными вкусовыми свойствами. Объекты и методы исследований Объектами исследований являлись хитозан (ХТ) с молекулярной массой 100 кДа и степенью деацетилирования 90 %, сукцинилированная форма хитозана (СХТ) с молекулярной массой 200 кДа и степенью замещения 75,1 % (ЗАО «Биопрогресс», Россия); смесь пептидов с молекулярной массой менее 10 кДа в составе гидролизата сывороточных белков молока (ГСБ) Peptigen IF 3080 WPH (массовая доля белка 80 %, Arla Foods Ingredients Group, Дания); L аргинин, L валин, L лейцин, L метионин и L триптофан (Sigma, США). Получение комплексов хитозана с гидролизатом сывороточных белков Готовили 0,1 % водные растворы хитозана и сукцинилированного хитозана, 15 % водный раствор пептидов сывороточных белков молока. В 50 мл 0,1 % раствора хитозана вносили 250 мкл 15 % раствора пептидов и тщательно перемешивали, измеряли активную кислотность и оптическую плотность раствора при длине волны 640 нм. Продолжали титровать 0,1 % раствор хитозана 15 % раствором пептидов в диапазоне концентрации белка 0,08–1,34 %. После каждого цикла внесения пептидов оценивали оптическую плотность и активную кислотность образцов. Эксперимент с сукцинилированной формой хитозана проводили аналогично. Активную кислотность опытных образцов определяли с помощью рН метра HANNA HI 83141 производства Hanna Instruments (Германия). Оптическую плотность растворов контролировали с использованием прибора Metertech UV/VIS SP 8001 производства Metertech (Тайвань). Получение биокомпозитов хитозана с аминокислотами (Арг, Вал, Лей, Мет и Трп) Согласно варианту 1 готовили 0,1 % водные растворы хитозана и сукцинилированного хитозана, 0,5 % водный раствор аминокислоты (Арг, Вал, Лей, Мет или Трп). 0,1 % раствор хитозана (20 мл) титровали 0,5 % раствором аминокислоты, добавляя по 80 мкл, до достижения концентрации АК в смеси, равной 0,002–0,05 %. После каждого этапа титрования контролировали оптическую плотность и активную кислотность полученных образцов. 0,1 % раствор сукцинилированного хитозана титровали в аналогичных условиях. В соответствии с вариантом 2 готовили водные растворы, содержащие 0,5 % хитозана или сукцинилированного хитозана и 0,5 % протеиногенной аминокислоты (Арг, Вал, Лей, Мет). В эксперименте с триптофаном готовили водные растворы, включающие 0,1 % хитозана или сукцинилированного хитозана и 0,05 % аминокислоты. Полученные растворы выдерживали при температуре 25 °С и постоянном перемешивании в течение 1 ч. Фиксировали значения оптической плотности и активной кислотности экспериментальных образцов. Образцы комплексов ХТ и СХТ с Трп, полученные согласно варианту 2, подвергали диализу. Диализ проводили с использованием трубчатой мембраны из целлюлозы с отсечкой по молекулярной массе 14 кДа (Sigma, США), продолжительность удаления несвязанного Трп составляла 4 ч. Впоследствии устанавливали содержание аминокислоты в диализате. Определяли оптическую плотность экспериментальных образцов при длине волны 280 нм (спектрофотометрический метод). Строили график зависимости оптической плотности от содержания Трп (0,0001–0,0016 %). В соответствии с калибровочным графиком вычисляли количество Трп в исходных растворах биокомпозитов и образцах диализатов. В случае применения колориметрического подхода, предусматривающего взаимодействие с реагентом Фолина-Чокалтеу (Sigma, США), измеряли оптическую плотность экспериментальных образцов комплексов ХТ–Трп и СХТ–Трп (вариант 2) и калибровочных проб Трп при длине волны 620 нм. В 200 мкл испытуемой пробы вносили 1000 мкл 0,5 М раствора гидроксида натрия, интенсивно перемешивали и добавляли 240 мкл реагента Фолина–Чокалтеу, выдерживали с темном месте 20 мин, измеряли оптическую плотность окрашенных образцов. Строили график зависимости оптической плотности калибровочных проб от содержания в них Трп (0,0001–0,010 %). С применением калибровочного графика рассчитывали концентрацию аминокислоты в растворах биокомпозитов и соответствующих диализатах. При установлении концентрации свободных и связанных аминокислот (Арг, Вал, Лей и Мет) по 500 мкл опытных образцов комплексов (вариант 2), вносили в пробирки с центрифужными фильтрами с отсечкой по молекулярной массе 10 кДа производства Merck Millipore (США). Фильтраты получали в результате центрифугирования при 14 тыс. об./мин на протяжении 15 мин. Определяли массовую долю общего белка в образцах комплексов и фильтратах в соответствии с ГОСТ 23327–98 . При статистической обработке экспериментальных данных рассчитывали среднее арифметическое значение ± доверительный интервал (n=3, α=0,05). Определение уровня горечи чистых соединений и комплексов с хитозаном. Органолептические свойства образцов оценивали с применением 10 балльной шкалы, где уровень 0 баллов указывал на отсутствие горечи, 1–2 – наличие очень слабого горького вкуса, 3–4 – присутствие слабой горечи, 5–6 – наличие умеренного горького вкуса, 7–8 баллов – обладание выраженным горьким вкусом, 9–10 – присутствие очень сильного горького вкуса. Степень выраженности горечи устанавливали с применением стандартных растворов хитозана, аминокислот и пептидов, что отражено в таблице 1. По итогам повторной оценки органолептических свойств (n=3) определяли среднее значение уровня горечи тестируемых проб. Оценка антиоксидантного действия биокомпозитов хитозана с триптофаном и пептидами. С целью определения антиоксидантной активности (АОА) опытных образцов использовали метод ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity Assay) [29]. Методика проведения эксперимента по оценке АОА описана в статье Тарун и соавт. [30]. Методика предполагает измерение АОА образцов по результатам взаимодействия с гидроксильными радикалами, для генерирования которых использована система Фентона. Степень восстановления флуоресценции флуоресцеина (А, %) определяли как соотношение уровня сигнала образца, в который внесены соединения с антиоксидантным потенциалом, к уровню сигнала контрольной пробы флуоресцеина (100 %). Получали графики, отражающие зависимость уровня флуоресценции флуоресцеина (A, %) от концентрации сухого вещества (сух. вещ.) в пробах. В соответствии с уравнением определяли концентрацию пробы, при которой наблюдается 50 % подавление флуоресценции флуоресцеина (IС50). По результатам 3 независимых экспериментов вычисляли среднее арифметическое значение ± доверительный интервал. Метод доверительных интервалов применяли для расчета достоверности различий между выборками экспериментальных данных. Результаты и их обсуждение Взаимодействие хитозана и его сукцинилированной формы с гидролизатом белков сыворотки. Охарактеризован процесс взаимодействия хитозана и его сукцинилированного производного с глубоким ферментативным гидролизатом сыворотки молока, обладающим горьким вкусом. Специфические органолептические свойства гидролизата обусловлены интенсивным расщеплением белков молочной сыворотки, которое сопровождается высвобождением "горькой" пептидной и аминокислотной фракции. В таблице 1 представлены результаты анализа органолептических свойств ряда аминокислот, обладающих горьким вкусом, в зависимости от их концентрации в водных растворах. Согласно экспериментальным данным при смешивании 0,1 % раствора хитозана с пептидами сывороточных белков молока в диапазоне концентраций 0,08–1,34 % показано возрастание активной кислотности среды на 1,9 ед. рН, как показано на рис. 1а. Таблица 1 Характеристика уровня горечи стандартных образцов аминокислот, пептидов и хитозана Наименование образца Уровень горечи, баллы Описание органолептических свойств 1 % раствор Арг 9 Очень сильная горечь 0,5 % раствор Арг 7 Выраженная горечь 1 % раствор Вал 6 Умеренная горечь 0,5 % раствор Вал 5 Умеренная горечь 1 % раствор Лей 10 Очень сильная горечь 0,5 % раствор Лей 8 Выраженная горечь 1 % раствор Мет 9 Очень сильная горечь 0,5 % раствор Мет 8 Выраженная горечь 1 % раствор Трп 7 Выраженная горечь 0,5 % раствор Трп 6 Умеренная горечь 0,05 % раствор Трп 2 Очень слабая горечь 0,01 % раствор Трп 2 Очень слабая горечь 5 % раствор ГСБ 8 Выраженная горечь 1,3 % раствор ГСБ 6 Умеренная горечь 0,25 % раствор ГСБ 0 Безвкусный 1 % раствор ХТ 4 Слабая горечь* 0,5 % раствор ХТ 3 Слабая горечь* 0,1% раствор ХТ 2 Очень слабая горечь* 1 % раствор СХТ 4 Слабая горечь* 0,5 % раствор СХТ 2 Очень слабая горечь* 0,1% раствор СХТ 0 Безвкусный * – Наличие специфического терпкого вкуса хитозана По итогам титрования при смешивании хитозана и пептидов наблюдается процесс протонирования, обусловливающий увеличение активной кислотности среды. Наряду с этим, показано существенное возрастание оптической плотности системы на 1,1 отн. ед. при увеличении содержания пептидной фракции с 1,0 до 1,3 %. Данное явление вызвано объединением макромолекул хитозана и пептидов, обладающих суммарным нейтральным зарядом. В соответствии со спектрофотометрическими исследованиями в процессе титрования системы ХТ–ГСБ точка эквивалентности установлена при концентрации пептидов 1,3 %. Результаты эксперимента по связыванию сукцинилированного хитозана и гидролизованной молочной сыворотки представлены на рис. 1б. При добавлении в раствор, содержащий 0,1 % СХТ, гидролизата в количестве от 0,08 до 1,34 % выявлено снижение показателя рН среды на 0,75 ед. В отличие от активной кислотности среды, не установлено изменение оптической плотности системы при внесении пептидов в раствор СХТ. Согласно измерению показателя рН, эквивалентное связывание сукцинилированного хитозана с пептидной фракцией наблюдается при добавлении 0,25 % гидролизата. Следовательно, снижение рН смеси сукцинилированной формы хитозана и гидролизата белков сыворотки молока сопряжено с высвобождением в среду протонов. Напротив, оптические свойства раствора сукцинилированного хитозана и пептидной фракции остались неизменными. Видимо, препятствием для масштабного процесса агрегации макромолекулярных композитов СХТ с пептидами является присутствие одноименных поверхностных зарядов. В рамках обобщения экспериментальных данных следует отметить, что при эквивалентном соотношении 1,0 г хитозана взаимодействует с 13,0 г пептидов, тогда как сукцинилированное производное связывает 2,5 г гидролизата. В целом, за счет поликатионных свойств хитозана достигается относительно высокая способность к связыванию пептидов. Наряду с этим, 75,1 % аминогрупп в составе СХТ замещены анионными сукцинатными группами, что приводит к существенному уменьшению потенциальных сайтов взаимодействия. а б Рисунок 1 Зависимость оптической плотности и активной кислотности 0,1 % раствора хитозана (а) и его сукцинилированной формы (б) от содержания пептидов сывороточных белков На следующем этапе исследований проанализированы вкусовые показатели глубокого гидролизата, производных хитозана и комплексов ХТ–ГСБ и СХТ–ГСБ. Результаты испытаний представлены на рис. 2. Установлено, что характерным горьким вкусом отличается пептидная фракция, наряду с этим пробы хитозана и его производного обладают слабой горечью и специфическим вяжущим вкусом. Уровень горечи зависит от концентрации внесенных ингредиентов. Так, при сопоставлении с чистыми соединениями обнаружено уменьшение выраженности горечи пептидов на 1–2 балла в составе биокомпозитов с хитозаном и его сукцинилированной формой. Рисунок 2 Характеристика уровня горечи стандартных образцов гидролизата, хитозана и его производного и соответствующих проб биокомпозитов Комплексообразование хитозана и его сукцинилированного производного с аминокислотами. На следующем этапе исследований по данным спектрофотометрического и рН-метрического методов изучены физико-химические параметры опытных образцов, полученных в результате смешивания 0,1 % растворов хитозана и сукцинилированного производного с аминокислотами (аргинин, валин, лейцин, метионин, триптофан) в диапазоне концентраций 0,002–0,05 %. По итогам эксперимента не выявлено достоверное изменение оптической плотности и активной кислотности опытных растворов, содержащих смеси полисахаридов и аминокислот. Согласно литературным данным связывание аминокислот с аминополисахаридом, обладающим поликатионными свойствами, достигается в результате электростатических сил взаимодействия [19, 31]. В отличие от макромолекулярных структур (белки, пептидная фракция), при внесении в растворы ХТ и СХТ низкомолекулярных соединений (аминокислоты) не установлено формирование коагулирующих комплексов и смещение показателя рН среды. Для определения оптимальных условий взаимодействия триптофана с хитозаном и его сукцинилированной формой получали растворы, содержащие 0,05 % аминокислоты и 0,1 % полисахаридов. С учетом содержания аминогрупп в составе глюкозамина, являющегося мономером хитозана, NH2–группы и триптофан присутствовали в молярном соотношении, равном 2 : 1. В случае применения сукцинилированного производного молярное соотношение триптофан : глюкозамин составляло 1 : 0,25 и триптофан : сукцинилглюкозамин – 1 : 1,3. Опытные образцы полисахаридов с триптофаном впоследствии подвергали диализу для отделения несвязанной аминокислоты. Спектрофотометрический и колориметрический метод использовали для установления доли триптофана в составе биокомпозитов. Количество исходного и диализованного триптофана являлось основой для определения доли связанного и свободного триптофана в опытных образцах комплексов. Так, содержание несвязанной аминокислоты равнозначно его количеству в растворе после диализа. Для определения доли триптофана в составе комплекса от исходного содержания аминокислоты (0,05 %) вычитали количество диализованной АК. Итоги проведенного эксперимента отражены с таблице 2. Подобные результаты достигнуты по итогам применения колориметрического и спектрофотометрического подходов для оценки биокомпозитов полисахаридов с триптофаном. Наряду с этим, отмечено снижение уровня сигнала в ультрафиолетовой и видимой области спектра для образцов смесей ХТ–АК и СХТ–АК по сравнению в контрольным растровом триптофана (0,05 %). Полученный эффект определяется связыванием аминокислоты с комплексообразователем и впоследствии изменением доступа к аминокислотному радикалу. В условиях эксперимента в 0,1 % растворе хитозана наблюдается связывание 0,046 и 0,047 % триптофана по данным спектрофотометрического и колориметрического метода соответственно, что указывает на комплексообразование 94 % внесенной аминокислоты. В случае анализа смеси, содержащей 0,1 % сукцинилированного хитозана, установлено взаимодействие полисахарида с 0,0278/0,0228 % АК (по итогам спектрофотомерии/колориметрии), что свидетельствует о комплексообразовании до 56 % триптофана. Так, эффективность связывания Трп в смеси в аминополисахаридом в 1,7 раза превышает показатели, полученные с эксперименте с сукцинилированным хитозаном. При молярном соотношении триптофан : глюкозамин, равном 1 : 0,25, полное комплексообразование аминокислоты может быть достигнуто в растворе, содержащем 0,05 % триптофана и 0,2 % сукцинилированного хитозана. На основании экспериментальных исследований, отраженных в таблице 2, определено оптимальное массовое соотношение триптофан : сукцинил-хитозан, равное 1 : 4. Следует отметить, что исходное молярное соотношение триптофан : глюкозамин при получении смеси аминокислоты и аминополисахарида составляет 1 : 2. В экспериментальных условиях при содержании в растворе 0,1 % хитозана и 0,05 % триптофана (массовое соотношение – 2 : 1) практически вся внесенная АК обнаруживается в составе комплекса, что обеспечивается двухкратным избытком протонированных аминогрупп. При массовом соотношении хитозан : триптофан, равном 1 : 1, ожидается связывание компонентов в эквимолярном количестве. Формирование биокомпозитов хитозана и сукцинил-хитозана с триптофаном обосновано данными спектрофотометрического и колориметрического методов. По итогам экспериментальной работы массовое соотношение Трп : полисахарид, равное 1 : 1 и 1 : 4, является оптимальным при комплексообразовании триптофана с хитозаном и его сукцинилированным производным соответственно. Эффективность связывания сукцинил-хитозана с триптофаном достаточно низкая по причине блокирования аминогрупп в результате сукцинилирования. В соответствии с данными литературы [19] именно NH2 группы полисахарида наиболее активно взаимодействуют с аминокислотами. Таблица 2 Содержание связанного и свободного триптофана в опытных пробах биокомпозитов с хитозаном и его сукцинилированным производным Наименование показателя Концентрация триптофана, % по данным спектрофотометрического метода (при длине волны 280 нм) по данным колориметрического метода (при длине волны 620 нм) Исходное содержание Трп в биокомпозитах* 0,050 0,050 Количество Трп в смеси с хитозаном (биокомпозит 0,1 % ХТ–0,05 % Трп) 0,0371±0,0034 0,0400±0,0037 Содержание свободного Трп в смеси с хитозаном (по результатам диализа) 0,0040±0,0001 0,0030±0,0003 Содержание связанного Трп в смеси с хитозаном (по результатам диализа)** 0,0460±0,0001 0,0471±0,0004 Количество Трп в смеси с сукцинилированным хитозаном (биокомпозит 0,1 % СХТ–0,05 % Трп) 0,0441±0,0054 0,0452±0,0036 Содержание свободного Трп в смеси с сукцинилированным хитозаном (по результатам диализа) 0,0222±0,0004 0,0272±0,0030 Содержание связанного Трп в смеси с сукцинилированным хитозаном (по результатам диализа)** 0,0278±0,0004 0,0228±0,0026 * – Указано количество внесенного Трп согласно методике получения биокомпозитов ХТ–Трп и СХТ–Трп. ** – Расчетное содержание Трп, которое определено путем вычитания количества несвязанной АК из исходного количества Трп, внесенного в смесь согласно методике. Впоследствии изготовлены экспериментальные образцы биокомпозитов полисахаридов с аргинином, валином, лейцином и метионином, которые подвергали фильтрации с отсечкой по молекулярной массе, равной 10 кДа. Далее в исходных пробах комплексов и полученных фильтратах определяли концентрацию общего азота и расчетным путем устанавливали долю аминокислот в биокомпозитах. Экспериментальные данные о содержании аминокислот, связанных с полисахаридами, отражены в таблицах 3 и 4. Таблица 3 Характеристика содержания аминокислот (аргинин, валин, лейцин, метионин, триптофан) в составе комплексов с хитозаном, органолептических свойств биокомпозитов ХТ–АК Состав комплекса Количество аминокислоты в составе биокомпозита Количество аминокислоты, связанное с 1,0 г или 0,0001 моль хитозана Уровень горечи (баллы) свободной аминокислоты / в составе комплекса % моль/л г моль 0,5 % ХТ + 0,5 % Арг н/о н/о – – Выраженная горечь (7) / выраженная горечь (7) 0,5 % ХТ + 0,5 % Вал 0,3276±0,0034 0,0280±0,0004 0,655±0,009 0,0559±0,0008 Умеренная горечь (5) / слабая горечь (4) 0,5 % ХТ + 0,5 % Лей 0,3846±0,0033 0,0293±0,0004 0,769±0,009 0,0586±0,0008 Выраженная горечь (8) / умеренная горечь (5) 0,5 % ХТ + 0,5 % Мет 0,2437±0,0125 0,0163±0,0011 0,487±0,030 0,0327±0,0022 Выраженная горечь (8) / умеренная горечь (5) 0,1 % ХТ + 0,05 % Трп 0,0460±0,0001 0,0023±0,0001 0,460±0,010 0,0225±0,0005 Умеренная горечь (6) / умеренная горечь (5)* Н/о – не обнаружено, * – указан уровень горечи для биокомпозита 0,5 % ХТ + 0,5 % Трп Таблица 4 Характеристика содержания аминокислот (аргинин, валин, лейцин, метионин, триптофан) в составе комплексов с сукцинилированным хитозаном, органолептических свойств биокомпозитов СХТ–АК Состав комплекса Количество аминокислоты в составе биокомпозита Количество аминокислоты, связанное с 1,0 г или 0,0001 моль сукцинилированного хитозана Уровень горечи (баллы) свободной аминокислоты / в составе комплекса % моль/л г моль 0,5 % СХТ + 0,5 % Арг н/о н/о – – Выраженная горечь (7) / выраженная горечь (7) 0,5 % СХТ + 0,5 % Вал 0,0192±0,0034 0,0016±0,0003 0,039±0,007 0,0066±0,0012 Умеренная горечь (5) / слабая горечь (3) 0,5 % СХТ + 0,5 % Лей 0,0512±0,0033 0,0039±0,0003 0,102±0,008 0,0156±0,0013 Выраженная горечь (8) / слабая горечь (4) 0,5 % СХТ + 0,5 % Мет 0,2687±0,0125 0,0180±0,0011 0,538±0,030 0,0721±0,0044 Выраженная горечь (8) / умеренная горечь (6) 0,1 % СХТ + 0,05 % Трп 0,0278±0,0004 0,0014±0,0001 0,278±0,004 0,0272±0,0004 Умеренная горечь (6) / слабая горечь (3)* Н/о – не обнаружено, * – указан уровень горечи для биокомпозита 0,5 % СХТ + 0,5 % Трп Согласно методике получения комплексов и расчетным данным, пробы биокомпозитов с аргинином, валином, лейцином и метионином включали 0,5 % хитозана и сукцинилированной формы, или 5×10 5 моль/л хитозана и 2,5×10 5 моль/л сукцинилированного производного (0,0272 и 0,0032 моль/л мономера глюкозамина относительно ХТ и СХТ). В условиях эксперимента валин и лейцин наиболее эффективно взаимодействуют с хитозаном, о чем свидетельствует насыщение остатков глюкозамина (NH2 групп) эквимолярным количеством аминокислот (таблицы 3 и 4). В эксперименте с Трп практически все внесенное количество АК находится в связанном с ХТ состоянии (таблицы 2–4). Комплексообразующие свойства сукцинилированного хитозана с аминокислотами снижаются в последовательности метионин – триптофан – лейцин – валин. Сравнительное невысокое количество тестируемых аминокислот включено в комплексы с производным хитозана по причине блокирования аминогрупп (75,1 %) в результате сукцинилирования аминополисахарида. В условиях проведения эксперимента аргинин не связывается с полисахаридами, как представлено в таблицах 3 и 4. В целом, комплексообразование с полисахаридами обусловлено свойствами радикалов аминокислот. Так, связывание с протонированными аминогруппами хитозана, обладающего поликатионными свойствами, возможно при наличии аминокислот в анионной форме (валин, лейцин, метионин и триптофан). Напротив, аргинин присутствует в растворе в протонированном состоянии, что препятствует взаимодействию с хитозаном и его производным. В рамках органолептической оценки выраженность горького вкуса комплексов аминополисахарида с триптофаном устанавливали с применением стандартных образцов триптофана, как показано в таблице 1. Для 0,5 % раствора хитозана характерны слабая горечь и вяжущий вкус, которым также обладает сукцинилированное производное (таблица 1). В составе биокомпозитов с хитозаном и его сукцинилированной формой показано снижение уровня горечи триптофана на 1–3 балла по сравнению с чистой аминокислотой (таблицы 3 и 4Так, комплексообразование с хитозаном и сукцинилированной формой обусловливает улучшение органолептических параметров триптофана. ). При низкой концентрации полисахаридов и триптофана (0,01–0,10 %) горький вкус не выявлен. Наряду с этим, уровень горечи комплексов хитозана и его сукцинилированной формы с валином, лейцином и метионином оказался на 2–4 балла меньше, чем чистых аминокислот, как представлено в таблицах 3 и 4. Для биокомпозитов с аргинином достоверное изменение уровня горького вкуса не установлено. Итоги тестирования органолептических свойств сопоставимы с эффективностью комплексообразования валина, лейцина, метионина и триптофана с полисахаридами и отсутствием связывания хитозана и сукцинилированной формы с аргинином. Влияние комплексообразования с хитозаном и его сукцинилированным производным на антирадикальные свойства пептидов и триптофана. Изучены антирадикальные свойства триптофана и гидролизата сывоторочных белков молока в результате связывания с хитозаном и его сукцинилированной формой. По данным восстановления флуоресценции флуоресцеина при различной концентрации антиоксиданта (0,0005–0,5 мг сух. вещ./мл) судили об антирадикальном потенциале триптофана, пептидов, полисахаридов и их биокомпозитов. Установлено, что тестируемые соединения эффективно восстанавливают флуоресценцию флуоресцеина (81–97 %). Рассчитан основной показатель антиоксидантной активности – IC50, при котором наблюдается 50 % уровень ингибирования гидроксильных радикалов. Согласно известным данным, антиоксидантное действие пептидов определяется восстанавливающим эффектом радикалов аминокислот, главным образом метионина, цистеина, тирозина и триптофана [32–34]. В соответствии с литературными источниками, природные полисахариды, с том числе хитин и хитозан, относятся к соединениям с антиоксидантным потенциалом [35, 36]. В связи с этим вычисления показателя антиоксидантной активности (IC50) производили как с учетом концентрации сухого вещества (сух. вещ.), так и содержания триптофана (или белка) в комплексах, что отражено в таблице 5. Таблица 5 Характеристика антиоксидантного действия триптофана, пептидной фракции, хитозана, сукцинилированного хитозана, опытных образцов биокомпозитов Название пробы IC50, мг сух. вещ./мл IC50, мг ГСБ (или Трп)/мл Пептидная фракция (ГСБ) 0,0260±0,0001 0,0208±0,0001 . Триптофан (Трп) 0,0119±0,0001 0,0117±0,0001 Хитозан (ХТ) 0,0352±0,0003 0 Сукцинилированная форма хитозана (СХТ) 0,0892±0,0003 0 Биокомпозит (0,1 % ХТ + 1,3 % ГСБ) 0,0140±0,0001 0,0104±0,0001 Биокомпозит (0,1 % СХТ + 0,25 % ГСБ) 0,0244±0,0010 0,0139±0,0006 Биокомпозит (0,5% ХТ + 0,5 % Трп) 0,0139±0,0001 0,0068±0,0001 Биокомпозит (0,5 % СХТ + 0,5 % Трп) 0,0157±0,0001 0,0077±0,0001 Следует отметить восстановление флуоресценции флуорофора до 95 и 90 % при внесении в тест-систему хитозана и его производного соответственно. Так, показатель IC50 для хитозана достигает 0,0352 мг сух. вещ./мл, тогда как для сукцинилированной формы – 0,0892 мг сух. вещ./мл. Бóльший уровень АОА хитозана, видимо, связан с высоким содержанием аминогрупп, которые блокируются в результате сукцинилирования. Показано, что пептидная фракция в составе гидролизата обладает относительно высоким антирадикальным действием, что в расчете на показатель IC50 составляет 0,0260 мг сух. вещ./мл и 0,0208 мг белка/мл. Наряду с этим, выявлено значительное превышение антиоксидантного эффекта триптофана по сравнению с пептидами, а именно в 2,2 и 1,8 раза соответственно в расчете на содержание азота и сухого вещества. Согласно экспериментальным данным выявлено возрастание антирадикального действия гидролизата сывороточных белков в результате взаимодействия с хитозаном и сукцинилированным хитозаном в 2,0 и 1,5 раза соответственно. Вместе с тем, антиоксидантная активность триптофана возросла в 1,7 раза после связывания с хитозаном, в случае с сукцинилированным производным – в 1,5 раза. Следует отметить бóльший антиоксидантный эффект биокомпозитов гидролизата и триптофана с хитозаном. В то же время взаимодействие пептидов и аминокислоты с сукцинилированной формой полисахарида менее эффективно. Предполагается, что увеличение антирадикального эффекта достигается в связи с лучшей растворимостью пептидов и триптофана посредством формирования биокомпозитов с хитозаном и его производным. Выводы По результатам экспериментальной работы охарактеризованы биокомпозиты хитозана и его сукцинилированного производного с гидролизатом белков молочной сыворотки. Согласно данным спектрофотометрического и рН-метрического анализа 1,0 г хитозана взаимодействует с 13,0 г пептидов, тогда как сукцинилированная форма связывает 2,5 г гидролизата. Показана относительно высокая эффективность комплексообразования хитозана с пептидами сывороточных белков молока. Отмечено улучшение органолептических свойств экспериментальных образцов комплексов хитозана и его сукцинилированного производного с пептидами, что проявилось в снижении уровня горького вкуса на 1–2 балла относительно чистого гидролизата. Представлена характеристика комплексов хитозана и его сукцинилированной формы с аминокислотами (аргинин, валин, лейцин, метионин, триптофан). В соответствии с экспериментальными исследованиями валин, лейцин и триптофан в эквимолярном соотношении взаимодействуют с остатками глюкозамина в составе хитозана. Невысокий комплексообразующий потенциал сукцинилированного хитозана объясняется низким содержанием свободных аминогрупп в связи с введением в структуру аминополисахарида остатков янтарной кислоты. Среди изученных аминокислот аргинин не образует комплексы с тестируемыми полисахаридами. Следует отметить, что в экспериментальных условиях валин, лейцин, метионин и триптофан находятся в анионном состоянии, вместе с тем аргинин – в катионной форме, что обусловливает возможность их связывания с поликатионным аминополисахаридом. По результатам органолептического анализа показано снижение выраженности горького вкуса комплексов хитозана и его сукцинилированного производного с валином, лейцином, метионином и триптофаном на 1–4 балла, наряду с этим изменение уровня горечи биокомпозитов полисахаридов с аргинином не выявлено. Согласно результатам флуориметрических исследований установлен высокий антиоксидантный потенциал триптофана и пептидов сывороточных белков молока. Значение IC50 для аминокислоты достигло 0,0117 мг Трп/мл, в случае гидролизата – 0,0208 мг белка/мл. Антирадикальный эффект подтвержден для хитозана (0,0352 мг ХТ/мл) и его сукцинилированного производного (0,0892 мг СХТ/мл). В составе биокомпозита с хитозаном показано увеличение антиоксидантного действия триптофана и гидролизата в 1,7 и 2,0 раза соответственно, тогда как в случае сукцинилированной формы – в 1,5 раза. Следует отметить более эффективное связывание гидролизата и триптофана с хитозаном посредством взаимодействия с аминогруппами полисахарида, что впоследствии обусловливает увеличение антиоксидантного действия триптофана и пептидов. Таким образом, в результате проведенного исследования получены биокомпозиты хитозана с пептидами молочной сыворотки и аминокислотами, обладающие высокой антиоксидантной активностью и улучшенными вкусовыми качествами. Они могут быть применены при производстве специализированных продуктов питания с гипоаллергенными свойствами.